Avaliação da participação da Na+K+ - ATPase e dos canais para K+ na reatividade de anéis isolados de aorta de ratos após infarto agudo do miocárdio

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dc.contributor.advisor1Stefanon, Ivanita
dc.contributor.authorDias, Fernanda Moura Vargas
dc.contributor.referee1Vassallo, Dalton Valentim
dc.contributor.referee2Bendhack, Lusiane Maria
dc.contributor.referee3Mill, José Geraldo
dc.contributor.referee4Pereira, Fausto Edmundo Lima
dc.date.accessioned2018-08-01T22:59:16Z
dc.date.available2018-08-01
dc.date.available2018-08-01T22:59:16Z
dc.date.issued2011-10-18
dc.description.abstractIntroduction: Na+K + -ATPase and K + channels are essential for the regulation of membrane potential in the vascular smooth muscle cells (VSMC). The activation or inhibition of these channels by neural, humoral and local vasoactive factors enable the physiological modulation of vascular tone. Studies show that the genesis of changes in vascular reactivity found in diseases such as hypertension and diabetes may be related to increased oxidative stress and alteration of NO bioavailability that influence the Na+K + -ATPase and K + channels of the VSM . Although several studies demonstrate changes in vascular reactivity after myocardial infarction (MI), no study to date evaluated the involvement of Na+K + -ATPase and K + channels in the alterations of vascular reactivity that occur in a chronic phase after MI, in rats with similar scar area (SA), with and without signs of heart failure (HF). Objective: To evaluate the functional activity of the Na+-K + -ATPase ouabain (OUA)-sensitive and K + channels in aortic rings of rats, after MI, with similar SA, with and without signs of HF. Materials and Methods: 89 male Wistar rats (220-360 g) were divided into: Sham operation (Sham, n = 37), animals after MI without signs of HF (Inf, n = 27) with signs of HF (HF, n = 25). The MI was surgically induced by occlusion of the left anterior coronary artery. 30 days after MI, animals were weighed, anesthetized (urethane, 1.2 g / kg, ip), catheterized and hemodynamic measurements were performed. The animals were sacrificed and the mass data were evaluated by the ratio of wet mass of the right ventricle (RV/BW), left ventricle (LV/BW) and lung (Lung/BW) by body mass (BW) of each animal. The aortic rings were removed, superfused with Krebs solution and aerated with carbogen mixture. The functional activity of the Na+-K + - ATPase OUA-sensitive was investigated by the relaxation induced by potassium (0- 10 mM) before and after OUA incubation, in rings with intact (E+) and removed endothelium (E-), and after L-NAME incubation. The participation of K+ channels in vascular reactivity was performed using the acetylcholine (ACh) induced relaxation after L-NAME and K+ channels blockers incubation: tetra-ethylammonium (TEA, nonselective blockers of K+ channels), Aminopiridin (4-AP, voltage-dependent K+ channels inhibitor - Kv), Iberiotoxin (blocker of Ca2+ channels sensitive of largeconductance - BKCa), Apamina (blocker of Ca2+ channels sensitive of smallconductance - SKCa) and the association of iberiotoxin and apamin. We performed the evaluation of α1 Na+-K + -ATPase and eNOS protein expression by Western blot. The production of superoxide anion (O2 .- ) "in situ" was performed by the fluorescence produced by oxidation of dihidroethidium (DHE). The SA was assessed by counting of the points on graph paper (planimetry) and histology with picrosirius red staining. We carried out evaluation of sensitivity (pEC50) and maximal response (Rmax) to ACh induced relaxation. To compare results between groups was performed ANOVA 1 and 2 ways, post hoc tests Tukey, Bonfferroni and Student t. Values were considered significant for *P < 0.05. The experimental protocols were approved (005/2007) by the Ethics Committee on Animal Use (CEUA-EMESCAM). Results: There were no differences between the SA (Inf: 33.67 ± 1.62, HF: 38.7 ± 2.45%), body mass (Sham: 322 ± 7; Inf: 341 ± 5, HF: 337 ± 7 g) and the ratio LV/BW (Sham: 2.12 ± 0.03; Inf: 2.19 ± 0.05, IC: 2.27 ± 0.07 mg/ g) between groups. However, there were increased in the RV/BW (Sham: 0.64 ± 0.09; Inf: 0.74 ± 0.04, HF: 1.25 ± 0.08*+ mg/g; *+P <0.01), Lung/BW (Sham: 4.41 ± 0.35, Inf: 3.91 ± 0.48, HF: 8.34 ± 0.69*+ mg/ g *+P< 0.01) and LVEDP (Sham: 5.26 ± 0.52, Inf: 7.20 ± 0.64, IC: 19.65 ± 2.13*+ ; *+P < 0.05) in the IC group when compared with Sham and Inf. The K + -induced relaxation was higher in Inf compared to Sham and HF animals. However, the endothelium removal, as well as the L-NAME or TEA incubation were able to abolish the differences between groups. In IC group K + -induced relaxation was increased in the presence of OUA compared with Sham. Removal of the endothelium and incubation with TEA were able to abolish the differences between the Sham and HF groups, but the LNAME incubation did not. In the HF group compared with Sham and Inf, L-NAME incubation decreased the K + -induced relaxation. After incubation with TEA, Rmax and the sensitivity of aortic rings to ACh Inf and HF decreased compared with Sham. The dAUC performed with the curves of ACh before and after incubation with 4-AP was higher in Inf animals compared with Sham and HF. Although the blocking with Apamin or Iberiotoxin has not caused the differences between the dAUC of groups, the double block resulted in the dAUC higher in HF group compared with Sham and Inf. There was no difference in protein expression of α1 Na+K + -ATPase between groups. However, the α1 Na+-K + -ATPase, p-eNOS and eNOS protein expression was diminished in the HF animals. In addition, a higher production of O2 .- in the Inf group compared with Sham and HF. Conclusions: In a chronic phase after experimental MI in rats with similar AI, with and without signs of HF, differences exist in mechanisms that induce vascular relaxation characterization of two distinct groups with functional responses. Among the mechanisms involved are increasing the participation of K+ channels and oxidative stress after MI, as well as decreased expression of eNOS and p-eNOS in the HF group of animals. Moreover, it is suggested that the Inf animals Kv channels are contributing more to the vascular relaxation, while the HF animals, seem to depend on the channels of KCa. Differences in vascular relaxation, according to the protocols used in this study, no relation to the change in function and expression of Na+K +- ATPase between the groups.eng
dc.description.resumoIntrodução: A Na+K+-ATPase e os canais para K+ são essenciais para a regulação do potencial de membrana das células do músculo liso vascular (MLV). A ativação ou a inibição destes canais por fatores vasoativos neurais, humorais e locais possibilitam a modulação fisiológica do tônus vascular. Evidências demonstram que a gênese das alterações da reatividade vascular encontradas em doenças como a hipertensão arterial e o diabetes podem estar relacionadas ao aumento do estresse oxidativo e a alteração da biodisponibilidade de NO que influenciariam o funcionamento da Na+K+-ATPase e dos canais para K+ do MLV. Embora vários trabalhos demonstrem alteração da reatividade vascular após o infarto do miocárdio (IM), nenhum estudo até o presente momento avaliou a participação dos canais para K+ e da Na+K+ATPase nas alterações da reatividade vascular que ocorrem em uma fase crônica após o IM, em ratos com área de cicatriz (AI) semelhante, com e sem sinais de insuficiência cardíaca (IC). Objetivo: Avaliar a atividade funcional da Na+K+-ATPase sensível à ouabaína (OUA) e dos canais para K+ em anéis de aorta de ratos após o IM, com mesma AI, com e sem sinais de IC. Materiais e Métodos: 89 ratos Wistar machos (220-360 g) foram distribuídos em: cirurgia fictícia (Sham, n= 37), animais após o IM sem sinais de IC (Inf, n= 27) e com sinais IC (IC, n= 25). O IM foi induzido cirurgicamente através da oclusão da artéria coronária anterior esquerda. 30 dias após o IM, os animais foram pesados, anestesiados (Uretana, 1,2 g/ kg, i.p.), cateterizados e as medidas hemodinâmicas foram realizadas. Em seguida, os animais foram sacrificados, os dados ponderais foram avaliados pela razão entre a massa úmida do ventrículo direito (VD/MC), ventrículo esquerdo (VE/MC) e pulmões (PP/MC) pela massa corporal (MC) de cada animal. Os anéis de aorta foram removidos, perfundidos com solução de Krebs e gaseificados com mistura carbogênica. A atividade funcional da Na+K+-ATPase sensível à OUA foi verificada pela técnica de relaxamento induzido pelo potássio (0-10 mM), antes e após a incubação com OUA, em anéis com endotélio intacto (E+), sem endotélio (E-) e após a incubação com L-NAME. A participação dos canais para K+ na reatividade vascular foi realizada pela técnica de relaxamento induzido pela acetilcolina (ACh), na presença do L-NAME e dos bloqueadores dos canais para K+: tetraetilamônio (TEA, não seletivo), Aminopridina (4-AP, inibidor dos canais para K+ voltagem dependentes - Kv), Iberiotoxina (inibidor dos canais para K+ ativados por Ca+2 de larga condutância - BKCa), Apamina (inibidor dos canais para K+ ativados por Ca+2 de baixa condutância - SKCa) e duplo bloqueio com Apamina e Iberiotoxina. Foi realizada a avaliação da expressão protéica das isoformas α1 da Na+K+-ATPase e da eNOS através do Western blot. Foi realizada a quantificação da produção do ânion superóxido (O2.-) ―in situ por fluorescência produzida pela oxidação do dihidroetídeo (DHE). A AI foi avaliada por contagem de pontos em papel milimetrado (planimetria) e por histologia com a coloração com picrosirius red. Realizou-se avaliação da sensibilidade (pEC50) e da resposta máxima (Rmax). Para comparar os resultados entre os grupos foi realizada ANOVA 1 e 2 vias, post hoc Bonfferroni e post hoc Tukey, além do Teste t Student quando necessário. Além disso, Os valores foram considerados significantes para *P< 0,05. Os protocolos experimentais foram aprovados (005/2007) pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA-EMESCAM). Resultados: Não houve diferença entre a AI (Inf: 33,67 ± 1,62; IC: 38,7 ± 2,45 %), a massa corporal (Sham: 322 ± 7; Inf: 341 ± 5; IC: 337 ± 7 g) e a razão VE/MC (Sham: 2,12 ± 0,03; Inf: 2,19 ± 0,05; IC: 2,27 ± 0,07 mg/g) entre os grupos estudados. Verificou-se, porém, aumento das razões VD/MC (Sham: 0,64 ± 0,09; Inf: 0,74 ± 0,04; IC: 1,25 ± 0,08*+ mg/g; *+P< 0,01), PP/MC (Sham: 4,41 ± 0,35; Inf: 3,91 ± 0,48; IC: 8,34 ± 0,69*+ mg/g; *+P<0,01) e da PDfVE (Sham: 5,26 ± 0,52; Inf: 7,20 ± 0,64; IC: 19,65 ± 2,13*+; *+P< 0,05) nos animais IC quando comparados com Inf e Sham. O relaxamento induzido pelo KCl foi maior em animais Inf quando comparados com os animais Sham e IC. Entretanto a remoção do endotélio, bem como incubação com L-NAME ou TEA foram capazes de abolir as diferenças entre os grupos. No grupo IC houve aumento do relaxamento induzido pelo KCl na presença de OUA quando comparados com os Sham. A remoção do endotélio e a incubação com TEA foram capazes de abolir as diferenças entre os grupos Sham e IC, mas a incubação com L-NAME não. No grupo IC comparado com Sham e Inf, a incubação com L-NAME diminuiu o relaxamento induzido pelo KCl. Após a incubação com TEA houve diminuição da Rmax e sensibilidade dos anéis de aorta dos animais Inf e IC à ACh comparados com os Sham. A dAUC realizada com as curvas de ACh antes e após a incubação com 4-AP foi maior nos animais Inf comparados com Sham e IC. Embora o bloqueio isolado com Apamina ou Iberiotoxina não tenha ocasionado diferenças nas dAUCs entre os grupos, o duplo bloqueio resultou em uma dAUC maior no grupo IC quando comparado com Sham e Inf. Não houve diferença na expressão protéica da α1 da Na+K+ATPase entre os grupos. Entretanto, a expressão protéica da eNOS e p-eNOS estava diminuída nos animais IC. Além disso, houve maior produção de O2.- nos grupos Inf e IC comparados com Sham. Conclusões: Em uma fase crônica após o IM experimental, em ratos com AI semelhante com e sem sinais de IC, existem diferenças nos mecanismos de relaxamento vascular que induzem a caracterização de dois grupos com respostas funcionais distintas. Dentre os mecanismos envolvidos estão o aumento da participação dos canais para K+ e do estresse oxidativo após o IM, bem como a expressão diminuída da eNOS e p-eNOS no grupo de animais IC. Além disso, sugere-se que nos animais Inf os canais Kv estejam contribuindo mais para o relaxamento vascular, enquanto os animais IC, parecem depender mais dos canais KCa. As diferenças no relaxamento vascular, de acordo com os protocolos utilizados no presente trabalho, não estariam relacionadas à alteração da função e expressão da Na+K+-ATPase entre os grupos.
dc.formatText
dc.identifier.citationDIAS, F. M. V., Avaliação da participação da Na+K+ - ATPase e dos canais para K+ na reatividade de anéis isolados de aorta de ratos após infarto agudo do miocárdio. 2011. Tese (Doutorado em Ciências Fisiológicas) - Universidade Federal do Espírito Santo, Centro de Ciências da Saúde, Vitória, 2011.
dc.identifier.urihttp://repositorio.ufes.br/handle/10/8045
dc.languagepor
dc.publisherUniversidade Federal do Espírito Santo
dc.publisher.countryBR
dc.publisher.courseDoutorado em Ciências Fisiológicas
dc.publisher.departmentCentro de Ciências da Saúde
dc.publisher.initialsUFES
dc.publisher.programPrograma de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas
dc.rightsopen access
dc.subject.cnpqFisiologia
dc.subject.udc610
dc.subject.udc612
dc.titleAvaliação da participação da Na+K+ - ATPase e dos canais para K+ na reatividade de anéis isolados de aorta de ratos após infarto agudo do miocárdio
dc.typedoctoralThesis
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