Clivagem in vitro do gene COL1A1 por CRISPR/Cas9: fundamentos para a geração de modelos experimentais

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dc.contributor.advisor1Paula, Flavia de
dc.contributor.advisor1IDhttps://orcid.org/0000-0001-8679-2982
dc.contributor.advisor1Latteshttp://lattes.cnpq.br/7913201450663683
dc.contributor.authorMelo, Daniel Moreira
dc.contributor.authorIDhttps://orcid.org/0009-0006-2579-1189
dc.contributor.authorLatteshttp://lattes.cnpq.br/4452821162268537
dc.contributor.referee1Santos, Eldamaria de Vargas Wolfgramm dos
dc.contributor.referee1IDhttps://orcid.org/0000-0003-3815-0760
dc.contributor.referee1Latteshttp://lattes.cnpq.br/4688343262832362
dc.contributor.referee2Nishimura, Agnes Lumi
dc.contributor.referee2IDhttps://orcid.org/0000-0001-5295-797X
dc.contributor.referee2Latteshttp://lattes.cnpq.br/4422870765994649
dc.date.accessioned2026-01-23T22:45:56Z
dc.date.available2026-01-23T22:45:56Z
dc.date.issued2025-12-18
dc.description.abstractGene editing mediated by the CRISPR/Cas9 system has become a central element of modern biotechnology, enabling genome modification in a rapid, accessible and highly precise manner. Among its applications, the generation of cellular models of genetic diseases is a key area, in which a critical step is the prior evaluation of the cleavage efficiency of Cas9/gRNA complexes before their use in living cells, functioning as an initial filter to select guide RNAs with higher functional potential. Among clinically relevant genes used as experimental models, COL1A1 stands out due to its essential role in type I collagen formation and because it harbors most of the mutations associated with Osteogenesis Imperfecta, a hereditary disease characterized by bone fragility and a broad clinical spectrum. The in vitro cleavage efficiency of the CRISPR/Cas9 system targeting the COL1A1 gene was investigated using DNA from five human cell lines of different origins. Guide RNAs were designed and selected based on computational predictions of efficiency and specificity, and the fragment corresponding to exon 2 and its respective guide RNA was used in the cleavage assays. The analyses revealed intermediate and consistent efficiencies among the tested cell lines, ranging from approximately 31% to 47%. The results demonstrate that the evaluated guide exhibits reproducible activity in different genomic contexts and support the use of this workflow as a preliminary step in the generation of genetically edited cellular models. Overall, the data reinforce the importance of in vitro validation prior to cellular editing and provide an experimental basis for future studies aimed at modeling COL1A1 mutations and investigating the molecular mechanisms of Osteogenesis Imperfecta.
dc.description.resumoA edição gênica mediada pelo sistema CRISPR/Cas9 tornou-se um elemento central da biotecnologia moderna, possibilitando modificar o genoma de forma rápida, acessível e com alto grau de precisão. Entre suas aplicações, a geração de modelos celulares de doenças genéticas é uma área chave, na qual uma etapa crítica consiste em avaliar previamente a eficiência de clivagem dos complexos Cas9/gRNA antes de sua utilização em células vivas, funcionando como um filtro inicial para selecionar RNAs guia com maior potencial funcional. Entre os genes clinicamente relevantes utilizados como modelo experimental, o COL1A1 se destaca por seu papel essencial na formação do colágeno tipo I e por concentrar a maioria das mutações associadas à Osteogênese Imperfeita, uma doença hereditária caracterizada por fragilidade óssea e amplo espectro clínico. Foi investigada a eficiência de clivagem in vitro do sistema CRISPR/Cas9 direcionado ao gene COL1A1 utilizando DNA de cinco linhagens celulares humanas de diferentes origens. RNAs guia foram desenhados e selecionados com base em predições computacionais de eficiência e especificidade, e o fragmento correspondente ao exon 2 e seu respectivo RNA guia foi utilizado para os ensaios de clivagem. As análises revelaram eficiências intermediárias e consistentes entre as linhagens testadas, variando entre aproximadamente 31% e 47%. Os resultados demonstram que o guia avaliado apresenta atividade reprodutível e sustentam a aplicação desse fluxo de trabalho como etapa preliminar na geração de modelos celulares geneticamente editados. Os dados reforçam a importância da validação in vitro na etapa prévia à edição celular e estabelecem bases experimentais para futuros estudos voltados à modelagem de mutações em COL1A1 e à investigação de mecanismos moleculares da Osteogênese Imperfeita.
dc.description.sponsorshipCAPES
dc.formatText
dc.identifier.urihttp://repositorio.ufes.br/handle/10/20824
dc.languagepor
dc.language.isopt
dc.publisherUniversidade Federal do Espírito Santo
dc.publisher.countryBR
dc.publisher.courseMestrado em Biotecnologia
dc.publisher.departmentCentro de Ciências da Saúde
dc.publisher.initialsUFES
dc.publisher.programPrograma de Pós-Graduação em Biotecnologia
dc.rightsopen access
dc.subjectEdição gênica
dc.subjectCRISPR
dc.subjectTerapia gênica
dc.subjectColágeno tipo I
dc.subjectEnsaio in vitro
dc.subject.cnpqBiotecnologia
dc.titleClivagem in vitro do gene COL1A1 por CRISPR/Cas9: fundamentos para a geração de modelos experimentais
dc.typemasterThesis
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