Análise de virulência e ação de antimicrobianos terapêuticos e potenciais antimicrobianos em células planctônicas e em biofilme de Escherichia coli enteroagregativa: um estudo in vitro e in vivo

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dc.contributor.advisor1Spano, Liliana Cruz
dc.contributor.advisor1IDhttps://orcid.org/0000000262056988
dc.contributor.advisor1Latteshttp://lattes.cnpq.br/7451382455806895
dc.contributor.authorGuerrieri, Caroline Gastaldi
dc.contributor.authorIDhttps://orcid.org/0000-0002-6230-7695
dc.contributor.authorLatteshttp://lattes.cnpq.br/7158387702645384
dc.contributor.referee1Sa, Marta Helena Branquinha de
dc.contributor.referee1IDhttps://orcid.org/0000-0002-9752-8148
dc.contributor.referee1Latteshttp://lattes.cnpq.br/2158584413298259
dc.contributor.referee2Schuenck, Ricardo Pinto
dc.contributor.referee2IDhttps://orcid.org/0000000198255762
dc.contributor.referee2Latteshttp://lattes.cnpq.br/1211608551542058
dc.contributor.referee3Nunes, Ana Paula Ferreira
dc.contributor.referee3IDhttps://orcid.org/0000-0001-7919-2938
dc.contributor.referee3Latteshttp://lattes.cnpq.br/7851528667690358
dc.contributor.referee4Pereira, Marcos Dias
dc.date.accessioned2024-05-30T00:54:29Z
dc.date.available2024-05-30T00:54:29Z
dc.date.issued2022-11-01
dc.description.abstractEnteroaggregative Escherichia coli (EAEC) is characterized by heterogeneity of potential virulence factors and biofilm formation. It can be classified as typical (tEAEC) and atypical (aEAEC) based on the presence of the AggR regulon, suggesting a higher virulence for tEAEC. As a result of its remarkable heterogeneity, its identification and determination of the susceptibility profile are not performed in the routine of laboratory diagnosis, and its treatment is done empirically. In addition, biofilm formation, which leads to the occurrence of persistent infections that may require antimicrobial therapy, confers resistance to antimicrobials and, in most cases, makes their eradication impossible. Therefore, the development of new therapeutic strategies for EAEC infections, mainly associated with biofilm formation, is sorely necessary. Phendione and its metallic derivatives (Ag-phendione and Cu-phendione) have shown effectiveness against several microorganisms, but so far their activity in E. coli isolates has not been investigated. Given the above, we aimed to analyze in vivo aspects of EAEC virulence and to analyze in vitro and in vivo the action of classic and new antimicrobials (phendione and its derivatives) on planktonic cells and EAEC biofilm. Regarding virulence analyses, we evaluated the survival of larvae after inoculation of the EAEC 042 wild-type and its AggR mutant. To evaluate the combination therapy with classic antimicrobials, the biofilm was formed in a peg-lid system, treated with combinations of antimicrobials from different therapeutic classes, and the inhibition and eradication potential of each combination was determined. We also analyzed the activity of phendione-derived compounds for EAEC in the planktonic form by determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and evaluating combinations of compounds with antimicrobials for resistant strains using checkerboard and time-kill methodologies. We also investigated the anti-biofilm activity of the compounds by determining the minimum biofilm inhibitory concentration (MBIC) and minimum biofilm eradication concentration (MBEC), in addition to other aspects such as the ability to inhibit the formation and disarticulate the mature biofilm and the possibility of using compounds associated with classic antimicrobials as a combined therapy to biofilm inhibition and eradication. Finally, we tested the treatment with Cu-phendione and Ag-phendione and their association with ampicillin in vivo in the G. mellonella model. Regarding the virulence of EAEC, we observed that the EAEC 042 mutant AggR strain showed a significant reduction in the mortality of inoculated larvae in relation to the wild-type strain, but its virulence was not completely lost. Combination therapy of classic antimicrobials in EAEC biofilms led to the eradication of 50% of the tested strains (2/4) in the ciprofloxacin-ampicillin and ciprofloxacin-tobramycin combinations. Phendione and its metal complexes showed high activity against EAEC strains in planktonic form with low MIC value, and, combining the metal complexes with antimicrobials by the checkerboard method, we observed an additive effect in most combinations. On the other hand, in time-kill experiments, the compounds showed synergism with both tetracycline and ampicillin. Regarding anti-biofilm activity, Cu-phendione showed the best result in the biofilm inhibition and eradication (68.6% - 24/35 strains), in the disarticulation of the mature biofilm (IC50 = 1.87 μM) and the inhibition of biofilm formation, mainly after six hours of incubation. Evaluating combination therapy in biofilms, we observed biofilm eradication of all strains (4/4) in combinations of Cu-phendione with cefoxitin, tobramycin, tetracycline, and ciprofloxacin, and in combinations of Ag-phendione with tobramycin and ciprofloxacin. Furthermore, the combination of ampicillin with Ag-phendione significantly increased the survival of G. mellonella larvae when compared to ampicillin administered alone. In conclusion, the results obtained here demonstrate that the in vivo virulence of EAEC seems to be related to the AggR regulon, but not exclusively. Regarding the treatment strategies for EAEC infections associated with biofilm formation, despite the combination therapy with two classic antimicrobials having presented better results than the treatment with antimicrobials alone, analyzed in a previous study, the phendione-derived compounds were more promising, especially for its ability to eradicate the biofilm either alone or in association with antimicrobials.
dc.description.resumoEscherichia coli enteroagregativa (EAEC) tem como características marcantes a heterogeneidade quanto aos potenciais fatores de virulência e formação de biofilme. Pode ser classificada em típica (tEAEC) e atípica (aEAEC) com base na presença do regulon AggR, sugerindo-se uma maior virulência para tEAEC. Em consequência de sua grande heterogeneidade, sua identificação e determinação do perfil de susceptibilidade não são realizadas na rotina de diagnóstico laboratorial e seu tratamento é feito de forma empírica. Além disso, a formação de biofilme, que leva à ocorrência de infecções persistentes que podem necessitar de terapia antimicrobiana, confere resistência a antimicrobianos e impossibilita sua erradicação. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para infecções por EAEC, principalmente associadas à formação de biofilme, são extremamente necessários. Fendiona e seus derivados metálicos (Ag-fendiona e Cu-fendiona) vêm se mostrando eficazes contra diversos microrganismos, porém até o momento não foi investigada sua atividade em isolados de E. coli. Diante do exposto, tivemos como objetivo analisar in vivo aspectos da virulência de EAEC e analisar in vitro e in vivo a ação de antimicrobianos clássicos e novos (fendiona e seus derivados) sobre células planctônicas e biofilme de EAEC. Em relação às análises de virulência, avaliamos a sobrevivência das larvas após a inoculação da cepa EAEC 042 selvagem e mutante para o regulon AggR. Para avaliação da terapia combinada com antimicrobianos clássicos, o biofilme foi formado em sistema peg-lid, tratado com combinações de antimicrobianos de diferentes classes terapêuticas e determinado o potencial de inibição e erradicação de cada combinação. Analisamos também a atividade dos compostos derivados da fendiona para EAEC na forma planctônica por meio da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e avaliação de combinações dos compostos com antimicrobianos para cepas resistentes, empregando as metodologias de checkerboard e curva tempo-morte. Também investigamos a atividade anti-biofilme dos compostos por meio da determinação da concentração inibitória mínima em biofilme (MBIC) e concentração mínima de erradicação de biofilme (MBEC), além de outros aspectos como a capacidade de inibir a formação e desarticular o biofilme maduro e a possibilidade de utilização dos compostos associados a antimicrobianos clássicos como terapia combinada para inibição e erradicação do biofilme. Por fim, testamos o tratamento com Cu-fendiona e Ag-fendiona e sua associação com ampicilina in vivo em modelo de G. mellonella. Em relação à virulência de EAEC, observamos que a cepa EAEC 042 mutante AggR apresentou redução significativa na mortalidade das larvas inoculadas em relação à cepa selvagem, porém sua virulência não foi completamente perdida. A terapia combinada de antimicrobianos clássicos em biofilme de EAEC levou à erradicação de 50% das cepas testadas (2/4) nas combinações ciprofloxacina-ampicilina e ciprofloxacina-tobramicina. Fendiona e seus complexos metálicos apresentaram alta atividade contra cepas de EAEC na forma planctônica com baixo valor de CIM e, combinando os complexos metálicos com antimicrobianos pelo método checkerboard, observamos efeito aditivo na maioria das combinações. Por outro lado, nos experimentos de curva tempo-morte, os compostos mostraram sinergismo tanto com a tetraciclina quanto com a ampicilina. Em relação a atividade em biofilme, Cu-fendiona apresentou o melhor resultado na inibição e na erradicação do biofilme (68,6% - 24/35 cepas), na desarticulação do biofilme maduro (IC50 = 1,87 μM) e na inibição da formação de biofilme, principalmente com seis horas de incubação. Avaliando a terapia combinada em biofilme, observamos a erradicação do biofilme de todas as cepas (4/4) nas combinações de Cu-fendiona com cefoxitina, tobramicina, tetraciclina e ciprofloxacina, e nas combinações de Ag-fendiona com tobramicina e ciprofloxacina. Além disso, a combinação de ampicilina com Ag-fendiona aumentou significativamente a sobrevivência das larvas de G. mellonella quando comparada à ampicilina administrada individualmente. Em conclusão, os resultados aqui obtidos demonstram que a virulência in vivo de EAEC parece estar relacionada ao regulon AggR, mas não exclusivamente. Em relação as estratégias de tratamento de infecções por EAEC associadas à formação de biofilme, apesar da terapia combinada com dois antimicrobianos clássicos ter apresentado melhores resultados que o tratamento com os antimicrobianos isoladamente, analisados em estudo prévio, os compostos derivados de fendiona se mostraram mais promissores especialmente pela sua capacidade de erradicar o biofilme tanto isoladamente como em associação com antimicrobianos clássicos.
dc.description.sponsorshipFundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
dc.formatText
dc.identifier.urihttp://repositorio.ufes.br/handle/10/16332
dc.languagepor
dc.publisherUniversidade Federal do Espírito Santo
dc.publisher.countryBR
dc.publisher.courseDoutorado em Doenças Infecciosas
dc.publisher.departmentCentro de Ciências da Saúde
dc.publisher.initialsUFES
dc.publisher.programPrograma de Pós-Graduação em Doenças Infecciosas
dc.rightsopen access
dc.subjectEAEC
dc.subjectVirulência
dc.subjectBiofilme
dc.subjectAntimicrobianos
dc.subject10-fenantrolina
dc.subject6-diona
dc.subjectCompostos Metálicos
dc.subject.br-rjbnsubject.br-rjbn
dc.subject.cnpqDoenças Infecciosas e Parasitárias
dc.titleAnálise de virulência e ação de antimicrobianos terapêuticos e potenciais antimicrobianos em células planctônicas e em biofilme de Escherichia coli enteroagregativa: um estudo in vitro e in vivo
dc.title.alternativetitle.alternative
dc.typedoctoralThesis
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