Purificação e caracterização bioquímica de uma protease do muco do peixe escorpião scorpaena plumieri

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dc.contributor.advisor-co1Gonçalves, Juliana Barbosa Coitinho
dc.contributor.advisor1Figueiredo, Suely Gomes de
dc.contributor.advisor1IDhttps://orcid.org/0000-0002-5363-8329
dc.contributor.authorPirovani, Milenna Machado
dc.contributor.referee1Paula, Heberth de
dc.contributor.referee2Menezes, Thiago Nunes de
dc.date.accessioned2024-12-12T20:19:13Z
dc.date.available2024-12-12T20:19:13Z
dc.date.issued2024-10-09
dc.description.abstractProteases are the efficient executioners of a common chemical reaction, the hydrolysis of peptide bonds. These enzymes appear in all domains of life, including plants, animals, and microorganisms. Due to their involvement in various important biological processes (e.g., blood coagulation, blood pressure regulation, protein processing, and antimicrobial activity), as well as their high specificity, these enzymes have clinical and industrial biotechnological potential. Recently, using a proteomic approach – ‘shotgun’ modality – our research group identified 228 proteins in the epidermal mucus of the Brazilian scorpionfish, Scorpaena plumieri, including various classes of proteases. In this study, a gelatinolytic protease from S. plumieri skin mucus (named Sp-MGP) was purified to homogeneity through a combination of two chromatographic steps: conventional gel filtration (Sephacryl S-200 column) and anion exchange HPLC (SynChropak AX300 column). The purification process was monitored by zymography (SDS-PAGE gelatin). Physicochemical studies indicated that the purified enzyme is an approximately 79-kDa monomeric glycoprotein, as estimated by SDS-PAGE under both reducing and non-reducing conditions. Zymogram analysis of Sp-MGP showed gelatinolytic zones of activity in the gel, with optimal activity at pH 6.0 to 9.0, which is typical of serine proteases. The enzyme stored in aqueous solutions at room temperature (25–30°C), 4°C, -25°C, and -80°C for 60 days did not lose its activity. Sp-MGP was also active on the thrombin (S-2238) and kallikrein (S-2266) synthetic substrates. The activity on S2238 was inhibited by aprotinin and benzamidine. These data reaffirm the suggestion that the purified enzyme is a serine protease, specifically of the thrombin-like and kallikrein-like subclasses. The information generated represents the initial step in the study of a novel protease and may contribute to exploring its biotechnological potential, in addition to providing knowledge about the diversity of molecules in fish skin mucus.
dc.description.resumoProteases são executores eficientes de uma reação química comum, a hidrólise de ligações peptídicas. Essas enzimas estão presentes em todos os domínios da vida, incluindo plantas, animais e microrganismos. Devido ao seu envolvimento em vários processos biológicos importantes (por exemplo, coagulação sanguínea, regulação da pressão arterial, processamento de proteínas e atividade antimicrobiana), bem como à sua alta especificidade, essas enzimas possuem potencial biotecnológico clínico e industrial. Recentemente, utilizando uma abordagem proteômica – modalidade 'shotgun' – nosso grupo de pesquisa identificou 228 proteínas no muco epidérmico do peixe-escorpião brasileiro, Scorpaena plumieri, entre elas, diversas classes de proteases. Neste estudo, uma protease gelatinolítica do muco da pele do S. plumieri (denominada Sp-MGP) foi purificada em forma homogênea por uma combinação de dois passos cromatográficos: filtração em gel convencional (coluna Sephacryl S-200) e troca aniônica (HPLC – coluna SynChropak AX300). O processo de purificação foi monitorado por zimografia (SDS-PAGE/gelatina). Estudos físico-químicos indicaram que a enzima purificada é uma glicoproteína monomérica de aproximadamente 79 kDa, conforme estimado por SDS-PAGE sob condições redutoras e não redutoras. A análise zimográfica da Sp-MGP mostrou zonas de atividade gelatinolítica no gel, com atividade ótima em pH 6,0 a 9,0, característico de serino-proteases. A enzima armazenada em soluções aquosas à temperatura ambiente (25 a 30°C), 4°C, -25°C e -80°C por 60 dias manteve sua atividade. Sp-MGP também apresenta atividade sobre os substratos sintéticos para trombina (S-2238) e calicreína (S-2266). A atividade em S-2238 foi inibida por aprotinina e benzamidina. Esses dados reafirmam a hipótese de que a enzima purificada é uma serino-protease, especificamente das subclasses semelhantes à trombina e à calicreína. As informações geradas representam o passo inicial no estudo de uma nova protease e podem contribuir para a exploração de seu potencial biotecnológico, além de fornecer conhecimento sobre a diversidade de moléculas no muco da pele de peixes.
dc.description.sponsorshipCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
dc.formatText
dc.identifier.urihttp://repositorio.ufes.br/handle/10/18220
dc.languagepor
dc.language.isopt
dc.publisherUniversidade Federal do Espírito Santo
dc.publisher.countryBR
dc.publisher.courseMestrado em Bioquímica
dc.publisher.departmentCentro de Ciências da Saúde
dc.publisher.initialsUFES
dc.publisher.programPrograma de Pós-Graduação em Bioquímica
dc.rightsopen access
dc.subjectMuco de peixe
dc.subjectPurificação
dc.subjectProtease
dc.subject.cnpqFarmacologia Bioquímica e Molecular
dc.titlePurificação e caracterização bioquímica de uma protease do muco do peixe escorpião scorpaena plumieri
dc.typemasterThesis
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