Catecol-O-metiltransferase de Paracoccidioides spp.: avanços na caracterização bioquímica e estrutural

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dc.contributor.advisor1Gonçalves, Juliana Barbosa Coitinho
dc.contributor.advisor1IDhttps://orcid.org/000000025892050X
dc.contributor.advisor1Latteshttp://lattes.cnpq.br/3448669742301744
dc.contributor.authorMartins, Marielly Moura
dc.contributor.authorIDhttps://orcid.org/0000-0003-1890-2654
dc.contributor.authorLatteshttp://lattes.cnpq.br/1985237393197546
dc.contributor.referee1Costa, Debora Maria Abrantes
dc.contributor.referee1Latteshttp://lattes.cnpq.br/6091932335152069
dc.contributor.referee2Paula, Renato Graciano de
dc.contributor.referee2IDhttps://orcid.org/0000-0002-6712-437X
dc.contributor.referee2Latteshttp://lattes.cnpq.br/9954356596390106
dc.date.accessioned2024-05-30T00:53:23Z
dc.date.available2024-05-30T00:53:23Z
dc.date.issued2022-03-30
dc.description.abstractFungi of the genus Paracoccidioides are causative agents of systemic mycosis Paracoccidioidomycosis (PCM), which primarily affects the lungs and may affect other tissues. PCM is endemic in Latin America and Brazil is the country that accounts for 80% of reported cases, followed by Colombia and Venezuela. The treatment is carried out with antifungal agents and is prolonged, expensive and with side effects, which discourages patients from following it, increasing the recurrence of the disease, in addition to the already reported cases of resistance. Thus, the search for new pharmacological targets remains important. The protein catechol-O-methyltransferase (COMT) may be a possible pharmacological target for the treatment of PCM because in other fungi it seems to participate in its survival in the host, however, in Paracoccidioides it has never been studied and its three-dimensional structure has not been resolved. COMT has low genetic variability among Paracoccidioides species and low similarity to human COMT. For this, Escherichia coli Rosetta(DE3) and Arctic Express bacteria were transformed with the expression vector pET28a(TEV) containing the comt gene were used for recombinant expression of this protein in order to obtain it in large quantity and functional. Different expression, lysis and affinity purification conditions were evaluated. After evaluation of different protocols, COMT showed soluble expression, albeit in small amounts, both when expressed in E. coli Arctic Express bacteria and in Rosetta. In E. coli Arctic Express, expression was confirmed by Western blot using anti-His antibody. In addition, samples obtained from the two strains and purified by affinity chromatography showed catechol-O-methyl-transferase activity. In silico analyzes were performed and showed that the three-dimensional structure of the COMT of Paracoccidioides predicted by the I-TASSER server presents the typical folding of O-methyltransferases with little divergence between different MTs identified in the PDB (especially located in the loop regions). Furthermore, by structural alignments, amino acid residues that interact with the substrate and with the COMT cofactors were also predicted and can guide docking studies for the design of inhibitors for the protein. With the characterization of COMT, it is intended that it will be possible to better understand the biology of fungi of the genus Paracoccidioides and create solid knowledge that can be used for the development of new and more powerful drugs, contributing to diversify the available antifungal arsenal.
dc.description.resumoFungos do gênero Paracoccidioides são agentes causadores da micose sistêmica Paracoccidioidomicose (PCM), que afeta primariamente os pulmões podendo acometer outros tecidos. A PCM é endêmica da América Latina e o Brasil é o país que responde por 80% dos casos relatados seguido da Colômbia e Venezuela. O tratamento é realizado com antifúngicos e é prolongado, de custo elevado e com efeitos colaterais, o que desencoraja os pacientes a segui-lo, aumentando a reincidência da doença, além dos já relatados casos de resistência. Assim, a busca por novos alvos farmacológicos continua sendo importante. A proteína catecol-O-metiltransferase (COMT) pode ser um possível alvo farmacológico para tratamento da PCM pois em outros fungos ela parece participar da sua sobrevivência no hospedeiro, porém, em Paracoccidioides ela nunca foi estudada e não possui sua estrutura tridimensional resolvida. A COMT possui baixa variabilidade genética entre as espécies de Paracoccidioides e baixa similaridade com a COMT humana. Para isso, bactérias Escherichia coli Rosetta(DE3) e Arctic Express foram transformadas com o vetor de expressão pET28a(TEV) contendo o gene comt foram utilizadas para expressão recombinante desta proteína com o intuito obtê-la em grande quantidade e funcional. Diferentes condições de expressão, lise e purificação por afinidade foram avaliadas. Após avaliação de diferentes protocolos, a COMT apresentou expressão solúvel, ainda que em pouca quantidade, tanto quando expressa em bactéria E. coli Arctic Express quanto em Rosetta. Em E. coli Arctic Express, a expressão foi confirmada por Western blot utilizando anticorpo anti-His. Além disso, amostras obtidas a partir das duas cepas e purificadas por afinidade apresentaram atividade de catecol-O-metiltransferase. Análises in silico foram realizadas e mostraram que a estrutura tridimensional da COMT de Paracoccidioides predita pelo servidor I-TASSER apresenta o enovelamento típico de O-metil-transferases com poucas divergências entre diferentes MTs identificadas no PDB (localizadas especialmente nas regiões de loops). Ademais, por alinhamentos estruturais, resíduos de aminoácidos que interagem com o substrato e com os cofatores da COMT também foram preditos e podem guiar os estudos de docking para o desenho de inibidores para a proteína. Com a caracterização da COMT pretende-se que seja possível entender melhor a biologia dos fungos do gênero Paracoccidioides e criar conhecimentos sólidos que poderão ser utilizados para o desenvolvimento de novos e mais poderosos fármacos contribuindo para diversificar o arsenal antifúngico disponível.
dc.description.sponsorshipFundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
dc.formatText
dc.identifier.urihttp://repositorio.ufes.br/handle/10/15965
dc.languagepor
dc.publisherUniversidade Federal do Espírito Santo
dc.publisher.countryBR
dc.publisher.courseMestrado em Bioquímica
dc.publisher.departmentCentro de Ciências da Saúde
dc.publisher.initialsUFES
dc.publisher.programPrograma de Pós-Graduação em Bioquímica
dc.rightsopen access
dc.subjectCatecol-O-metiltransferase
dc.subjectParacoccidioides
dc.subjectExpressão heteróloga
dc.subject.br-rjbnsubject.br-rjbn
dc.subject.cnpqFarmacologia Bioquímica e Molecular
dc.titleCatecol-O-metiltransferase de Paracoccidioides spp.: avanços na caracterização bioquímica e estrutural
dc.title.alternativetitle.alternative
dc.typemasterThesis
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